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ⓘ Test di mutagenesi. I test di mutagenesi sono analisi genetiche utilizzate per verificare la capacità di indurre mutazioni genetiche da parte di agenti fisici o ..




                                     

ⓘ Test di mutagenesi

I test di mutagenesi sono analisi genetiche utilizzate per verificare la capacità di indurre mutazioni genetiche da parte di agenti fisici o chimici; sono dunque usati per indicare la genotossicità di un agente. I test possono essere compiuti su cellule, tessuti o interi organismi: nei primi due casi si parla di test di mutagenesi in vitro ; nel terzo di test in vivo. La capacità di provocare mutazioni è spesso associata alla capacità di provocare cancro: per questo molti test hanno lo scopo di valutare la cancerogenicità di un agente valutandone la mutagenicità. Bisogna però precisare che non tutti i mutageni sono anche cancerogeni.

                                     

1. Storia e legislazione

Lazione mutagena di agenti fisici era già stata ipotizzata alla fine dellOttocento e successivamente avvalorata da numerosi esperimenti su Drosophila melanogaster. In seguito gli studi del genetista Thomas Hunt Morgan mostravano probabile una capacità analoga anche da parte di agenti chimici; per questi agenti risultati importanti si ottennero negli anni quaranta con i lavori di Charlotte Auerbach e colleghi. In seguito al riconoscimento di un numero crescente di sostanze mutagene e degli eventi di Hiroshima e Nagasaki si resero sempre più necessari provvedimenti per il controllo di queste sostanze.

Un contributo importante venne nel 1973 dallidea del batteriologo Bruce Ames di usare la Salmonella typhimurium come base per un esame semplice in grado di misurare quantitativamente le capacità mutagene delle sostanze chimiche. Sviluppando questo test, che prese il suo nome test di Ames, il ricercatore fece unulteriore osservazione importante: le sostanze dotate di capacità mutagena erano spesso anche se non sempre già conosciute per lazione cancerogena. Questo fornì un notevole contributo per la comprensione dei processi alla base della formazione dei tumori.

                                     

2.1. Test in vitro Con microrganismi

Le colture batteriche più utilizzate sono di organismi modello come Escherichia coli e Salmonella typhimurium, i modelli eucarioti più utilizzati sono ceppi di lievito Saccharomyces cerevisiae ; è oggi limitato invece limpiego di funghi come Neurospora crassa e Aspergillus nidulans. I test con batteri sono molto diffusi: i batteri infatti si replicano molto rapidamente, hanno genomi e proprietà biologiche molto conosciuti: i test sono così molto veloci ed economici. Il principale svantaggio risiede nelle differenze notevoli tra batteri e uomo. Per questo motivo i batteri sono spesso modificati geneticamente per renderli più simili possibile a cellule umane. Tra le principali modificazioni ci sono:

  • linserimento nelle cellule di plasmidi con geni relativi a sistemi di riparazione error prone soggetti ad errore, che riparano alcune mutazioni introducendone però di altre.
  • linattivazione di geni coinvolti nei sistemi di riparazione in modo da aumentare leffetto delleventuale mutageno aumento del tasso di mutazione.
  • laggiunta al terreno di coltura di S9mix, una soluzione consistente in omogeneato di fegato di ratto centrifugato a 9000 g/m con laggiunta di coenzimi e un tampone. La soluzione serve in quanto spesso alcune sostanze sono inizialmente in forma non attiva promutageni e sono convertiti nella forma capace di provocare mutazioni da enzimi epatici; lS9mix contiene enzimi analoghi a quelli umani e compiono questo processo di attivazione nel caso in cui la sostanza analizzata sia un promutageno.
  • luso di ceppi con mutazioni in geni che codificano per proteine che fungono da trasportatori di membrana. Le mutazioni servono per rendere le membrane più permeabili a molecole anche di grandi dimensioni: il mutageno entra così più facilmente nella cellula.

Data la natura del materiale genetico dei microrganismi, i test in questione sono solitamente usati per saggiare linduzione di mutazioni puntiformi. Nelle varie procedure, il test serve a verificare linduzione della mutazione nellorganismo verificandone una variazione nel fenotipo. Due sono i sistemi utilizzabili:

  • il sistema della reversione - il ceppo di partenza presenta già una mutazione; è noto sia il gene mutato che il tipo di mutazione presente. Si tratta il ceppo con il presunto mutageno e si verifica la presenza di colonie revertenti; anche qui più esse sono più lagente è mutageno.
  • il sistema della mutazione in avanti - in cui sono usati ceppi con fenotipo selvatico per un gene marcatore ; questi vengono esposti allagente e dopo incubazione si isolano e contano le colonie con fenotipo mutato. Il numero di colonie mutate è direttamente proporzionale alla mutagenicità dellagente.

Il principale vantaggio del secondo sistema è la conoscenza della mutazione inizialmente presente nel ceppo. Nel primo sistema una mutazione di qualsiasi tipo può avere effetto; nel secondo si usano ceppi con una prima mutazione tale che solo un numero limitato di tipi di mutazioni possano dare reversione se non addirittura un solo tipo. Con il sistema della reversione quindi si può sapere in modo diretto che tipo di mutazione è stata indotta e caratterizzare la modalità dazione del mutageno.

I principali test che usano il sistema della reversione sono il Test di Ames e il test noto con il nome commerciale Mutatox: in questultimo caso i batteri in esame sono batteri bioluminescenti che, in seguito a una mutazione, hanno perso questa capacità. Se il composto in esame è mutageno, trattando con esso questi batteri alcuni subiscono reversione, ed emettono una luminescenza che viene misurata dallo strumento. Lintensità della luminescenza dipende dalla quantità di revertanti e, quindi, dal potere mutageno della sostanza.

                                     

3. Con cellule di mammifero

Le cellule di mammifero più usate sono cellule uovo di hamster cinese o linfociti umani. Quando le cellule derivano da tessuti queste possono essere divise per poi essere incubate in terreno di coltura liquido con metodi meccanici o enzimatici tramite tripsinizzazione ad esempio. Possono essere utilizzate cellule direttamente prelevate da tessuto vivo e formare così colture cellulari primarie, caratterizzate però da un numero limitato di divisioni cellulari prima della degenerazione; oppure linee cellulari ingegnerizzate in modo da poter compiere un numero elevato di divisioni colture cellulari immortalizzate. I vantaggi sono lavere a disposizioni sistemi biologici uguali o molto simili a quelli umani, quindi simulare in modo molto vicino alla realtà lazione che avrebbero gli agenti sulluomo. Le mutazioni che si mira a identificare sono prevalentemente su larga scala cromosomiche e genomiche.

                                     

3.1. Con cellule di mammifero Test in metafase

Per questa tecnica, dopo essere state esposte al potenziale mutageno, le cellule sono sincronizzate e bloccate in metafase tramite colchicina; in seguito a procedure di fissaggio le cellule vengono poi lisate delicatamente e da esse viene prelevato il materiale genetico. I cromosomi isolati vengono poi "colorati" per visualizzarne eventuali alterazioni. Non dando informazioni sulla sequenza nucleotidica questa tecnica è utile a investigare solo la presenza di mutazione su larga scala. La tecnica più semplice consiste nel trattare i cromosomi con sostanze che li colorano in modo omogeneo come ad esempio lorceina o il DAPI: in questo modo si può facilmente osservare in un cariotipo la presenza di cromosomi in eccesso o in difetto e quindi linduzione da parte del mutageno di mutazioni genomiche.

                                     

3.2. Con cellule di mammifero Bandeggiamento

Tramite la tecnica di banding i cromosomi assumono una colorazione bande. Esistono diversi tipi di bandeggiamento, ma in tutti i casi ciascun cromosoma nel cariotipo presenterà uno schema pattern di bande caratteristico; in questo modo ciascuno di essi è facilmente distinguibile dagli altri. Con il banding si possono determinare i cromosomi in numero non corretto o, tramite unanalisi accurata dei pattern di banda, identificare siti in cui sono avvenute mutazioni cromosomiche.

                                     

3.3. Con cellule di mammifero FISH

Libridizazione fluorescente in situ Fluorescent hybridazation in situ o FISH permette di colorare i cromosomi in metafase tramite sonde con opportuni cromofori cromosom painting. Grazie al possibile uso di differenti cromofori e alla loro combinazione si è reso possibile colorare ciascuno dei 24 diversi cromosomi umani con un colore diverso tecnica SKY. Rispetto ai cromosomi bandeggiati, quelli colorati con FISH permettono di ottenere informazioni più accurate e molto più facilmente. In caso di traslocazione, ad esempio, si vedrebbero efficacemente due cromosomi ibridi, per metà di un colore per metà di quello del cromosoma con cui cè stato lo scambio.

                                     

3.4. Con cellule di mammifero Test in interfase

I test in interfase sono spesso utili perché più rapidi ed economici di quelli in metafase che richiedono molte procedure di preparazione. Anche in questo tipo di analisi le cellule da studiare sono bloccate, ma subito dopo la divisione meiotica. I principali test sono il test del micronucleo e il test di condensazione prematura dei cromosomi abbreviato in PCC.

                                     

3.5. Con cellule di mammifero Test di analisi di danno al DNA

Questi test servono per scoprire la presenza di danni al singolo o al doppio filamento di DNA rispettivamente single strand break o SSB e double strand break o DBS. I principali test sono il test della cometa e il test della sintesi di DNA non programmato. I test in questione sono spesso di rapida esecuzione ma non danno altra informazione che leventuale presenza del danno senza specificarne la natura; sono per questo poco usati o affiancati da test più specifici.

                                     

4. Test in vivo

I test in vivo permettono di usare sistemi più complessi e di tener conto di fattori influenti sullattività mutagenica di un composto che non sono contemplati in semplici colture cellulari. Sono solitamente usati ceppi di topo Mus musculus di ratto o criceto, spesso anche ingegnerizzati per ottimizzare i processi. Se si vuole analizzare la presenza di mutazioni somatiche sono di solito prelevati piccoli frammenti di organi e disgregati nelle singole cellule che li compongono tramite trattamento con tripsina o collagenasi. Su queste cellule possono essere poi compiuti test analoghi a quelli descritti in precedenza, come il test del micronucleo o lanalisi cariotipica in metafase. I test in vivo sono poi utili nel studiare le mutazioni indotte nelle cellule germinali; le loro varie fasi di sviluppo sono infatti difficili da ottenere in vitro.

                                     

5. Test di mutagenesi ambientale

Oltre che sulle singole sostanze, è possibile effettuare test di mutagenesi anche su matrici ambientali: si tratta cioè di valutare il potere mutageno non di una singola sostanza ma di un intero ambiente.

Si possono individuare due grandi categorie di test:

  • test in situ, ovvero effettuati sul posto, che sono quindi più significativi perché, generalmente, non necessitano campionamento e sono più diretti;
  • test ex situ, ovvero effettuati in laboratorio su campioni prelevati dallambiente, che hanno il vantaggio di essere svolti avendo a disposizione tutto il necessario per il corretto svolgimento di analisi anche complesse, che richiedono strumenti non facilmente trasportabili.
                                     

5.1. Test di mutagenesi ambientale Test sullaria

Nellaria, i principali mutageni si trovano, aggregati tra loro, nel particolato atmosferico: è quindi necessario campionare questo particolato per poi svolgere delle analisi. A questo scopo si usano campionatori costituiti da filtri attraverso i quali una pompa fa passare un preciso volume daria: il materiale depositato sul filtro viene poi estratto in laboratorio ed analizzato con test di mutagenesi come quelli descritti sopra.

Alternativamente a questi test ex situ, è possibile effettuare test in situ usando organismi viventi ad esempio piante di cui si conoscono dettagli del genoma, esposti per un certo periodo di tempo allaria in esame; al termine del periodo di test si estrae il DNA e lo si analizza, per individuare eventuali mutazioni occorse.

                                     

5.2. Test di mutagenesi ambientale Test sullacqua

Anche in questo caso sono possibili test ex situ ed in situ.

Test in laboratorio possono essere effettuati prelevando campioni di acqua, concentrando le sostanze presenti, e trattando con i campioni così ottenuti le colture batteriche o gli organismi sui quali si svolgeranno i test.

Test in situ possono essere svolti allevando, nellacqua sotto esame, specie acquatiche come mitili o alcuni tipi di pesci sulle quali poi si possano facilmente individuare eventuali mutazioni quindi specie il cui genoma o cariotipo sia conosciuto e facilmente analizzabile, o specie particolarmente sensibili nelle quali sia facilmente osservabile linsorgenza di tumori.

                                     

5.3. Test di mutagenesi ambientale Test sul suolo

Per effettuare test in laboratorio, il campionamento dei suoli è uno stadio necessario e particolarmente importante: perché sia significativo di tutto il suolo in esame occorre prelevare porzioni secondo schemi precisi che tengano in considerazione tutta larea del terreno. Successivamente, unaltra fase delicata è lestrazione, dal campione, degli inquinanti. Sono stati elaborati molti metodi diversi, lo scopo di questi è ottenere una soluzione nella quale gli inquinanti siano presenti non tanto con la stessa concentrazione con cui si trovano nel suolo, ma risecchiando la loro biodisponibilità, cioè la quantità con cui essi vengono assorbiti dagli organismi viventi. Su questo estratto si possono poi effettuare i test descritti precedentemente.

In alternativa si possono effettuare test con organismi superiori ad esempio Tradescantia. Questi possono essere effettuati trapiantando piante coltivate in serra nel terreno da analizzare, o altrimenti immergendo talee della pianta nellestratto del terreno ottenuto come spiegato in precedenza. Le piante possono essere analizzate con il test del micronucleo.