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ⓘ Miniprep. La Miniprep è una tecnica di laboratorio utilizzata in biologia molecolare per lestrazione, su piccola scala, di DNA plasmidico dai batteri trasformat ..




Miniprep
                                     

ⓘ Miniprep

La Miniprep è una tecnica di laboratorio utilizzata in biologia molecolare per lestrazione, su piccola scala, di DNA plasmidico dai batteri trasformati che lo contengono. Le miniprep sono utilizzate durante i processi di clonaggio per analizzare cloni batterici.

                                     

1. Utilizzo

Luso di plasmidi permette di replicare il materiale genetico in batteri o per trasferire certi geni in altri organismi. La resa di plasmidi dipende da numerosi fattori: il ceppo batterico, il terreno di coltura utilizzato, il tipo di plasmide le condizioni di coltura agitazione, temperatura. I batteri generalmente utilizzati per la replicazione di plasmidi esogeni sono della specie Escherichia coli.

Tale tecnica è utile allorquando si vogliano utilizzare dei plasmidi come vettori di espressione o di clonaggio, per determinare, in genere dopo un passaggio di ligazione e di successiva trasformazione, quali cloni batterici contengano il plasmide di interesse.

                                     

2. Procedimento

Esistono diverse vie per ottenere una miniprep: il metodo classico utilizza tutta una serie di soluzioni o buffer che servono a compiere i diversi step dellestrazione dalla rottura delle cellule fino allottenimento del DNA plasmidico. Questa tecnica si basa sul processo di lisi alcalina, proposta da Birnboim e Doly nel 1979.

Attualmente nei laboratori di ricerca vengono utilizzati dei kit forniti da diverse industrie del settore contenenti, già preparate, le soluzioni per lestrazione del DNA; per ragioni commerciali, la composizione di ogni singola soluzione non è nota.

                                     

2.1. Procedimento Crescita dei batteri

I plasmidi sono solitamente purificati a partire da colture liquide trasformate, seminate su terreno solido e isolate. I plasmidi ingegnerizzati sono solitamente dotati di uno o più geni in grado di conferire resistenza agli antibiotici solitamente ampicillina o kanamicina, che permette ai batteri che sono stati trasformati con successo di moltiplicarsi in un terreno di coltura selettivo. Nelle miniprep il volume di terreno liquido è di circa 1-5ml.

                                     

2.2. Procedimento Lisi

I batteri di ogni campione, dopo essere stati risospesi in un tampone isotonico, subiscono la lisi alcalina grazie allaggiunta di un tampone contenente idrossido di sodio 0.2N e la successiva neutralizzazione con laddizione di un tampone contenente sodio acetato. Lidrossido di sodio, oltre a rompere la parete batterica, denatura il DNA. La fase di neutralizzazione, riportando il pH ai valori fisiologici, permette la rinaturazione del DNA plasmidico superavvolto ma non di quello genomico, a causa delle grandi dimensioni di questultimo.

                                     

2.3. Procedimento Purificazione del DNA

Dopo la centrifugazione dei campioni, che rimuove le membrane, le pareti cellulari e il DNA genomico, il DNA plasmidico in soluzione viene purificato tramite laddizione di una soluzione fenolo/cloroformio: le proteine vengono denaturate e solubilizzate nella fase organica inferiore mentre il DNA plasmidico si colloca nella fase acquosa superiore.

La fase acquosa viene prelevata e si procede con la precipitazione del DNA addizionando etanolo. Dopo la precipitazione si rimuove letanolo e il DNA precipitato può essere risospeso in acqua o in un altro opportuno tampone.

Un altro metodo di purificazione si ha con la separazione del DNA su gradiente di CsCl-EtBr.