Топ-100
Indietro

ⓘ Southern blot. Il Southern blotting è una metodologia usata in biologia molecolare per rilevare la presenza di specifiche sequenze di DNA in una miscela comples ..




                                     

ⓘ Southern blot

Il Southern blotting è una metodologia usata in biologia molecolare per rilevare la presenza di specifiche sequenze di DNA in una miscela complessa. Prende il nome dal suo inventore, Edwin Mellor Southern.

Altri metodi di rilevamento che impiegano principi simili, ma utilizzando RNA o proteine, sono stati successivamente denominati in riferimento al nome di Edwin Southern. Poiché il metodo è omonimo al biologo, Southern è in maiuscolo come è convenzionale dei nomi propri; i nomi di altri metodi di rilevamento sono in minuscolo per analogia a questa convenzione.

                                     

1. Procedura

  • Il foglio di nitrocellulosa viene separato dal gel e vengono saturate le cariche positive con DNA eterologo solitamente DNA da salmone; processo di preibridizzazione.
  • Il gel viene coperto da un foglio di nitrocellulosa o nylon a carica positiva e sopra di questo viene posta una pila di fogli assorbenti. Per capillarità la soluzione tenderà ad attraversare il gel, il foglio di nitrocellulosa e risalirà nei fogli assorbenti. I sali trascinano i segmenti di DNA perfettamente in verticale, depositandoli sullo strato di nitrocellulosa con il quale i segmenti instaurano legami elettrostatici dovute alle cariche negative dei gruppi fosfato del DNA che si legano alle positive della membrana. Da notare che in questo passaggio il DNA non sale grazie a una forza elettrica come nella prima elettroforesi ma solo per capillarità.
  • Il gel viene immerso in una soluzione alcalina per denaturare il DNA; solitamente si tratta di una soluzione molto diluita di NaOH per un tempo pari a 15 minuti.
  • Un campione eterogeneo di DNA genomico viene trattato con enzimi di restrizione e successivamente sottoposto ad elettroforesi su gel dagarosio o di poliacrilammide. Nel gel sarà possibile osservare uno smear, ossia una striscia continua; non si vedranno bande nette perché il DNA genomico digerito con lenzima di restrizione ha tantissimi punti di taglio, quindi sul gel si troveranno tantissimi frammenti che migreranno con velocità diverse in base al diverso peso molecolare.
  • Il foglio di nitrocellulosa viene quindi immerso in una soluzione contenente una sonda marcata in vario modo che ibridizza con sequenze di DNA complementari presenti sul foglio, identificandole. La sonda viene creata con tecniche di amplificazione del DNA. Libridizzazione della sonda con il DNA può avvenire con diversi gradi di "stringenza" a seconda delle finalità dellesperimento, consentendo una ibridizzazione con specificità anche inferiore al 100%.
  • A seguito del lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le sonde non ibridate, si fa una lastra fotografica che metta in evidenza dove la sonda ha legato il DNA genomico.
                                     

2. Risultati

Libridazione della sonda sul frammento di DNA specifico sulla membrana del filtro indica che questo frammento contiene una sequenza di DNA complementare alla sonda. La fase di trasferimento del DNA dal gel di elettroforesi a una membrana consente un facile legame della sonda di ibridazione marcata con il DNA frazionato per dimensione. Consente inoltre il fissaggio degli ibridi sonda-target, necessari per lanalisi mediante autoradiografia o altri metodi di rilevazione. Le macchie meridionali eseguite con DNA genomico digerito da enzimi di restrizione possono essere utilizzate per determinare il numero di sequenze ad esempio copie di geni in un genoma. Una sonda che si ibrida solo per un singolo segmento di DNA che non è stato tagliato dallenzima di restrizione produrrà una singola banda in un southern blot, mentre si osserveranno più bande quando la sonda si ibrida con diverse sequenze molto simili ad esempio, quelle che può essere il risultato della duplicazione della sequenza. La modifica delle condizioni di ibridazione ad esempio, aumento della temperatura di ibridazione o riduzione della concentrazione di sale può essere utilizzata per aumentare la specificità e ridurre libridazione della sonda in sequenze simili al 100%.

                                     

3. Applicazioni

Libridazione del Southern Blotting può essere utilizzata per la clonazione basata su omologia della sequenza aminoacidica del prodotto proteico del gene bersaglio. Gli oligonucleotidi sono progettati in modo tale da essere simili alla sequenza target. Gli oligonucleotidi sono sintetizzati chimicamente, radiomarcati e usati per screenare una libreria di DNA o altre raccolte di frammenti di DNA clonati. Le sequenze che si ibridano con la sonda di ibridazione vengono ulteriormente analizzate, ad esempio, per ottenere lintera sequenza di lunghezza del gene bersaglio.

Il southern blot può anche essere utilizzata per identificare siti metilati in determinati geni. Particolarmente utili sono le nucleasi di restrizione MspI e HpaII, entrambe le quali riconoscono e si dividono allinterno della stessa sequenza. Tuttavia, HpaII richiede che una C allinterno di quel sito sia metilata, mentre MspI scinde solo il DNA non metilato in quel sito. Pertanto, tutti i siti metilati allinterno di una sequenza analizzata con una sonda particolare saranno scissi dal primo, ma non dal secondo, enzima.



                                     

4. Tecniche affini

Successivamente allinvenzione del Southern blotting vennero elaborate altre tecniche simili, che per una sorta di scherzo tra scienziati, vennero designate con aggettivi riferiti ai punti cardinali, in analogia con il Southern blotting, che trae però il nome dallinventore: Edwin Mellor Southern.

  • Western blotting, per lidentificazione delle proteine.
  • Northwestern blotting, per lanalisi delle interazioni tra RNA e proteine.
  • Eastern blotting, tecnica per lanalisi delle modificazioni post traduzionali delle proteine.
  • Northern blotting, tecnica analoga al Southern blot, ma per lRNA.
  • Southwestern blotting, per lanalisi delle interazioni tra DNA e proteine.