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ⓘ Elettroforesi delle sieroproteine. In chimica e in medicina, lelettroforesi proteica o ETF è un metodo danalisi delle proteine presenti nel sangue e nel siero. ..




                                     

ⓘ Elettroforesi delle sieroproteine

In chimica e in medicina, lelettroforesi proteica o ETF è un metodo danalisi delle proteine presenti nel sangue e nel siero. È quindi un metodo di separazione di particelle cariche elettricamente, che avviene attraverso elettroforesi, cioè tramite il passaggio continuo di corrente elettrica in una soluzione.

                                     

1. Funzionamento

Le particelle cariche migrano verso lelettrodo di carica opposta con una velocità di migrazione o mobilità elettroforetica legata a numerosi fattori dipendenti dalla natura del mezzo e dal campo elettrico applicato e soprattutto dalla massa, dalle dimensioni, dalla carica e dalla forma delle varie particelle. Nellelettroforesi le proteine reagiscono come molecole elettricamente cariche in soluzione acida o alcalina: esse sono infatti polimeri di amminoacidi, e quindi presentano dei gruppi carbossilici e gruppi amminici. In base al pH della soluzione tampone, dove scorre la corrente, possono essere indotte cariche negative o positive. In particolare in una soluzione alcalina il gruppo carbossilico della molecola viene neutralizzato secondo la reazione:

-COOH + OH - → -COO - + H 2 O

formando ioni negativi che lasceranno nella proteina una netta carica negativa. In una soluzione leggermente acida, invece, il gruppo amminico associa un protone come si nota nella reazione:

-NH 2 + H + → -NH 3 +

formando così ioni -NH 3 + e quindi lasciando sulla molecola una carica nettamente positiva.

Volendo effettuare una siero-elettroforesi si impiega un tampone a pH alcalino il quale conferisce alle molecole proteiche una carica negativa rendendole solubili senza sottoporle a denaturazione.

                                     

2. Interpretazione

Esistono due classi principali nelle sieroproteine: albumina e globuline.

Albumina

Solitamente albumina e globuline sono in proporzioni simili, ma lalbumina è molto più corta, e carica negativamente mostrando una concentrazione visiva maggiore. Esiste inoltre una piccola banda superiore allalbumina chiamata pre-albumina.

Globuline

Le globuline sono classificate a seconda delle bande relative:

  • La zona alfa α o delle alfaglobuline è suddivisa in due bande
  • alfa 2 - aptoglobina, alfa2-macroglobulina, alfa2-antiplasmina, protrombina, ceruloplasmina, colinesterasi.
  • alfa 1 - alfa 1 -antitripsina, alfa 1 - glicoproteina acida, alfa-fetoproteina.
  • La zona beta β o delle betaglobuline: transferrina, lipoproteine a bassa densità LDL, complemento c3
  • La zona gamma γ o delle gammaglobuline: immunoglobuline ; paraproteine; le bande monoclonali appaiono solitamente in questa zona.
                                     

3. Strumentazione

Lattrezzatura necessaria per eseguire una separazione elettroforetica è costituita da:

  • Un densitometro: spettrofotometro in grado di misurare la trasmissione della luce attraverso una striscia colorata anziché attraverso una soluzione contenuta in una cuvetta. La striscia viene posta su un apposito carrello trasportatore ad avanzamento micrometrico, che avanza a velocità costante di fronte al fototubo in modo che lo spettrofotometro possa leggere le diverse strisce. Il densitometro dà le percentuali delle diverse frazioni proteiche su un display digitale; se è collegato a un registratore si ottiene un grafico avente in ordinata i valori dellassorbanza e in ascissa la posizione delle bande. Il densitometro è stato oramai sostituito dal computer, che mediante un programma specifico effettua la lettura della striscia elettroforetica ne elabora poi il grafico.
  • Dei ponti: sono supporti in plastica su cui vengono stese e fissate le strisce in modo tale che le estremità siano immerse nel tampone, che salendo per capillarità, potrà distribuirsi su tutta la striscia.
  • Una camera umida per ETF: vaschetta di alluminio di plastica divisa da un setto in due scompartimenti in ognuno dei quali viene posto il tampone. In ogni compartimento pesca un elettrodo costituito da un filo di platino e i due elettrodi sono collegati ai rispettivi poli di un alimentatore.
  • Delle strisce elettroforetiche: rappresentano il supporto solido e poroso per la migrazione. Possono essere di varia natura a seconda del grado di risoluzione che si deve ottenere. Il gel di acetato di cellulosa è il supporto di più largo impiego per la sua capacità multifrazionativa, per la sua economicità e conservabilità in metanolo al 30% si conserva per un tempo indeterminato.
  • Un alimentatore: converte le corrente di rete alternata in corrente continua stabilizzata. Esso fornisce una differenza di potenziale costante e consente alloperatore di scegliere la tensione di corrente desiderata.
  • Un applicatore: ha la funzione di depositare una piccolissima quantità di siero sotto forma di sottile striscia rettilinea e perpendicolare alla striscia elettroforetica. Sono disponibili in commercio diversi tipi di applicatori, singoli o multipli, in grado di depositare quantità costanti e consentire una buona standardizzazione del metodo.

Questo tipo di analisi viene svolta utilizzando vari tipi di supporto, in particolare con acetato gelatinizzato e il gel dagarosio. Ultimamente viene sempre più usata lelettroforesi su capillari direttamente da provetta primaria, a vantaggio della preparazione del campione e della velocità di analisi.